Originar din Kent, Connecticut, MacFarlane este absolvent al Rhode Island School of Design, unde a studiat animația, obținând o diplomă de Bachelor of Fine Arts. A fost animator și scriitor pentru Hanna-Barbera la mai multe emisiuni de televiziune, inclusiv Johnny Bravo, Cow and Chicken și Laboratorul lui Dexter, înainte de a crea propria sa serie pentru 20th Century Fox, intitulată Family Guy, în 1999. MacFarlane a continuat să co-creeze American Dad! în 2005, The Winner în 2007 și The Cleveland Show în 2009 pentru 20th Century Fox.
Ca actor, a avut apariții ca invitat în emisiuni precum Gilmore Girls, The War at Home și FlashForward. Interesul lui MacFarlane pentru science fiction și fantezie l-a condus la apariții cameo și ca invitat în Star Trek: Enterprise și la dublarea personajului Johann Kraus în Hellboy II: The Golden Army, regizat de Guillermo del Toro. În 2008, a creat propria sa serie pe YouTube, intitulată Seth MacFarlane's Cavalcade of Cartoon Comedy. Ca performer, MacFarlane a cântat în mai multe locații, inclusiv Carnegie și Royal Albert Hall.
MacFarlane a câștigat mai multe premii pentru munca sa la Family Guy, inclusiv două Premii Primetime Emmy și un Annie Award. În 2009, a câștigat Webby Award pentru Film & Video Person of the Year. A fost subiectul criticilor din partea grupurilor de supraveghere a televiziunii, cum ar fi Parents Television Council, care condamnă regulat Family Guy pentru indecența sa. Vorbește ocazional la universități și colegii din întreaga Statele Unite și este un susținător al drepturilor homosexualilor.
În episodul din 10 februarie 2011 al emisiunii de varietăți TBS, Conan, MacFarlane a anunțat că regizează primul său film de lungmetraj, Ted. Filmul îi are în rol principal pe Mark Wahlberg ca adult, care, în copilărie, și-a dorit ca ursulețul său de pluș să prindă viață. MacF