La televizor, este cunoscut pentru interpretarea personajului principal în seria ABC Doogie Howser, M.D. (1989–1993), pentru care a fost nominalizat la premiul Golden Globe pentru Cel mai bun actor – Serii de televiziune muzicale sau comedie, precum și pentru Barney Stinson în seria CBS How I Met Your Mother (2005–2014, pentru care a fost nominalizat la patru premii Emmy) și Contul Olaf în seria Netflix A Series of Unfortunate Events (2017–2019).
Harris este, de asemenea, cunoscut pentru rolul său ca personajul principal în musicalul lui Joss Whedon Dr. Horrible's Sing-Along Blog (2008) și o versiune fictivă a sa în seria de filme Harold & Kumar (2004–2011). Alte filme ale sale includ Starship Troopers (1997), Beastly (2011), The Smurfs (2011), The Smurfs 2 (2013), A Million Ways to Die in the West (2014) și Gone Girl (2014).
În 2010, Harris a câștigat două premii la cea de-a 62-a ediție a premiilor Primetime Emmy, câștigând pentru Cel mai bun actor invitat într-o serie de comedie pentru apariția sa ca invitat în Glee și pentru Cel mai bun program special de clasă pentru prezentarea premiilor Tony în 2009; a câștigat acest din urmă premiu de încă trei ori pentru prezentarea show-ului în 2011, 2012 și 2013. De asemenea, a prezentat premiile Primetime Emmy în 2009 și 2013 și a fost gazda celei de-a 87-a ediții a premiilor Academiei în 2015, devenind astfel primul bărbat deschis gay care a prezentat premiile Academiei. În 2014, a jucat rolul principal în Hedwig and the Angry Inch pe Broadway, pentru care a câștigat premiul Tony 2014 pentru Cel mai bun actor principal într-un musical.
Harris a fost numit unul dintre cei 100 de oameni cei mai influenți de către revista Time în