Născut în Palermo, Guadagnino a petrecut o parte din copilărie în Etiopia. Cu toate acestea, familia s-a întors în Italia pentru a scăpa de Războiul Civil Etiopian. Guadagnino și-a început cariera regizând scurtmetraje și documentare. A debutat în lungmetraj cu The Protagonists (1999), primul dintre numeroasele sale colaborări cu actrița Tilda Swinton. Următorul său film, Melissa P. (2005), a fost un succes comercial în Italia, dar a avut parte de recenzii critice mixte.
Guadagnino a câștigat și mai multă recunoaștere cu trilogia sa Desire, care constă din filmele I Am Love (2009), A Bigger Splash (2015) și Call Me by Your Name (2017). Acesta din urmă i-a adus recunoaștere internațională. Suspiria (2018), un remake al filmului din 1977, a fost prima incursiune a lui Guadagnino în genul horror. A fost un eșec la box office și a polarizat criticii. Proiectele următoare ale lui Guadagnino au fost We Are Who We Are (2020), o miniserie de coming-of-age pentru HBO, filmul de horror romantic Bones and All (2022), filmul sportiv romantic Challengers (2024) și drama romantică de epocă Queer (2024).
Guadagnino a regizat mai multe documentare, inclusiv Bertolucci on Bertolucci (2013) și Salvatore: The Shoemaker of Dreams (2020). Pe lângă realizarea de filme, a fost implicat în lumea modei, regizând reclame pentru branduri precum Fendi și Salvatore Ferragamo. În 2012, Guadagnino a fondat compania de producție Frenesy Film Company. De asemenea, a produs Belluscone: A Sicilian Story (2014), The Truffle Hunters (2020), Salvatore: The Shoemaker of Dreams (2020), Holiday și Enea (2023).