Gambon a apărut în numeroase producții ale operelor lui William Shakespeare, precum Othello, Hamlet, Macbeth și Coriolanus. Gambon a fost nominalizat la treisprezece Premii Olivier, câștigând de trei ori pentru A Chorus of Disapproval (1985), A View from the Bridge (1987) și Man of the Moment (1990). În 1997, Gambon a debutat pe Broadway în Skylight de David Hare, obținând o nominalizare la Premiul Tony pentru Cel mai bun actor într-o piesă.
Gambon și-a făcut debutul în film în Othello (1965). Alte filme notabile ale sale includ The Cook, the Thief, His Wife & Her Lover (1989), The Wings of the Dove (1997), The Insider (1999), Gosford Park (2001), Amazing Grace (2006), The King's Speech (2010), Quartet (2012) și Victoria & Abdul (2017). Gambon a apărut de asemenea în filmele lui Wes Anderson The Life Aquatic with Steve Zissou (2004) și Fantastic Mr. Fox (2009). Gambon a câștigat o recunoaștere mai largă prin rolul său de Albus Dumbledore în seria de filme Harry Potter, între 2004 și 2011, înlocuindu-l pe Richard Harris după moartea acestuia în 2002.
Pentru munca sa la televizor, a primit patru Premii BAFTA pentru The Singing Detective (1986), Wives and Daughters (1999), Longitude (2000) și Perfect Strangers (2001). De asemenea, a primit două nominalizări la Premiile Primetime Emmy pentru Path to War (2002) și Emma (2009). Alte proiecte notabile ale lui Gambon includ Cranford (2007) și The Casual Vacancy (2015). În 2017, a primit Premiul pentru întreaga carieră de la Academia Irlandeză de Film și Televiziune. În 2020, a fost clasat pe locul 27 în lista celor mai mari actori de film din Irlanda, realizată de The Irish Times.