Glover a avut o varietate de roluri în film, teatru și televiziune. A jucat rolul soțului personajului lui Whoopi Goldberg, Celie, în celebra adaptare literară a romanului The Color Purple, și ca locotenentul James McFee în filmul Witness. A avut roluri principale în alte filme, inclusiv To Sleep with Anger, Predator 2, Angels in the Outfield și Operation Dumbo Drop. A câștigat premiul Independent Spirit pentru Cel Mai Bun Actor Principal pentru rolul său din To Sleep with Anger, regizat de Charles Burnett.
De asemenea, a avut roluri secundare importante în Silverado, Witness, A Rage in Harlem, Dreamgirls, Shooter, Death at a Funeral, Beyond the Lights, Sorry to Bother You, The Last Black Man in San Francisco, The Dead Don't Die, Lonesome Dove și Jumanji: The Next Level. Glover a obținut pentru prima dată titlul de actor principal în Predator 2, continuarea filmului de acțiune science fiction Predator. De-a lungul carierei sale, a avut și mai multe apariții cameo, apărând, de exemplu, în videoclipul lui Michael Jackson "Liberian Girl" din 1987.
În 1994, și-a făcut debutul în regie cu scurtmetrajul Override, difuzat pe canalul Showtime. Tot în 1994, Glover și actorul Ben Guillory au fondat Robey Theatre Company în Los Angeles, concentrându-se pe teatru creat de și despre oameni de culoare.